《少女骑士物语》改编自日本同名恋爱冒险游戏，以马上长矛比武为题材，讲述主人公水野贵弘的青春竞技故事。贵弘过去在日本的马上长矛比武中所向披靡，为了测试自己的实力而到国外留学，参加更多大赛。然而在一次大会中意外受伤导致败北，他因此从马上长矛比武引退，转而修习骑士辅助人员。又到了将举办大赛的季节，贵弘在学院中与多位少女骑士相遇。作品围绕贵弘以辅助者身份支持少女骑士们展开，她们各自怀揣对马上长矛比武的热爱与目标，在赛场上挥枪驰骋、追逐荣耀。贵弘凭借过往经验为她们提供战术指导与心理支持，帮助她们克服伤病、压力与强敌。随着赛事推进，贵弘与少女骑士们建立起深厚羁绊，也逐渐直面自己因伤引退的心结。动画融合竞技热血与青春恋爱元素，既有紧张激烈的马上长矛对决，也有细腻温馨的日常互动。贵弘在辅助他人的过程中重新找回对这项运动的热爱，少女骑士们也在他的帮助下不断成长，向更高目标发起挑战。